【摘要】人体在接触物体后，会在其表面留下少量接触DNA。对接触DNA的检验是目前法医DNA检验技术的热点和难点。接触DNA的检验成功率差异较大，受各环节多重因素影响。影响接触DNA检验成功率的主要因素有接触DNA检材的准确发现、接触DNA的提取与纯化以及扩增策略的选择和结果分析等。本文详述了接触DNA检验过程的进展及研究展望。

    【关键词】法医物证学；接触DNA；检材提取；DNA提取与纯化

    随着DNA检验灵敏度的提高和各级公安机关应用DNA技术破案意识的日益增强，DNA技术早已成为侦查破案的强有力的科技手段之一。但同时由于犯罪嫌疑人反侦查意识增强，DNA检验的主要对象由血迹、精斑、毛发等常规生物检材转变为一些存在形式特殊、多样的非常规生物检材，即接触DNA。

    接触DNA是指通过皮肤接触遗留在客体表面的DNA，主要来源于人体皮肤脱落的上皮细胞^［1］。1997年，Oorschot等^［1］首次在指纹上提取到了微量的接触DNA。接触DNA并不简单等同于低拷贝DNA(low copy number，LCN)^［2］和微量DNA(trace DNA)^［3］。一般把基因组含量小于100pg的样本称为低拷贝DNA，基因组含量少于0.1mg的样本称为微量DNA，两者主要侧重于DNA的含量，而接触DNA则侧重于DNA的来源。在近几年的研究中，游离DNA^［4］(cell free nucleic DNA，CNAs)备受关注，目前认为属于接触DNA的来源之一。

    对于接触DNA检测成功率，文献报道结果差异较大。Harbison等^［1］统计了908份接触DNA检材的检验成功率，结果45%的检材获得了DNA分型(包括完整、部分和混合分型)。Daly等^［5］对100例玻璃表面遗留的接触DNA研究，结果检验成功率为9%。接触DNA检测步骤复杂，检验成功率易受各环节多因素影响。

    接触DNA的检验主要包括关键接触DNA检材的发现及接触部位的确定，接触DNA的提取与纯化，扩增与电泳，STR分型及结果分析等。

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    1 关键检材的发现及接触部位的确定

    在实际检案过程中，提取的接触DNA检材并非多多益善，有关人员应根据具体案情结合缜密的现场分析来重点提取检材。除此之外，还应注意隐蔽位置和除第一现场外的有关检材，减少漏检及检材过多导致的检验准确率降低。

    检材获取后，确定其表面接触部位并非易事。Sewell等^［6］利用指纹显现方法寻找接触部位。张辉等^［7］用EZ-tape 粘取器按上、中、末段分别粘取一起刑事案件所获的刀鞘上的脱落细胞，检验结果显示接触DNA提取成功率：中段＞上段＞末段。大多数情况下应利用经验并结合现场分析来缩小检材的重点部位。当无法确定检材的重点部位时，可以在检材表面尽可能多地选取不同部位进行接触DNA检材的提取尝试。

    2 接触DNA的提取方法

    实际工作中，由于操作的不规范及所用器械的不洁净，接触DNA检材会有一定损坏和污染。接触DNA提取方法的选取，通常由接触DNA含量及检材类型而定。影响接触DNA含量的因素^［1］有个体差异、载体的物理属性、接触时间、接触力度、接触面积、遗留时间、检材所处环境的温度和干燥时间^［8］等。

    对于犯罪现场检材上可能存在的接触DNA，常用的提取方法有胶带粘取法^［9］、两步擦拭法^［10］、直接剪取法^［1］、负压吸附法^［11］、震荡冲洗法^［12］等。

    2.1 胶带粘取法

    胶带粘取法^［9］是利用胶带的粘性吸附载体表面的附着物，容易控制富集脱落细胞的范围。适用于硬质、表面光滑、不易渗透或与身体接触面较小的物品上DNA的提取^［1］。但由于胶带的粘性导致所粘附的脱落细胞不易裂解。

    常用的胶带粘取装置有EZ-tape^［13］、脱落细胞粘取器^［14］等，常用的胶带类型^［15］有Scenesafe FAST tape、Scotch Magic tape等。王冲等^［13］采用脱落细胞提取装置EZ-tape(公安部物证鉴定中心研制)，利用其携带方便、操作简单、可针对重点部位进行提取、能避免物证提取、保存过程中遭受污染等优点，对某案件现场手机套上两处可疑被触摸处进行粘取从而获得相关检材。赵春鹤等^［14］利用粘取器粘取，成功收集到粘附在衣服袖口、剪刀柄、水杯、手表，手套、鞋带、拖鞋等二十余份不同载体表面的脱落细胞。研究结果表明，脱落细胞粘取器防污染；精致小巧，操作简便；提取膜片粘性好，脱落细胞转移成功率高；便于凸凹不平载体表面、细小载体及角落的粘取使用等。Oorschot等^［15］利用Scenesafe FAST tape、Scotch Magic tape两种胶带从4种不同材料上提取样本，通过实验对比发现，样本材料的不同，所用胶带类型的差异，胶带表面的粘附力以及粘取次数的不同等，都会影响接触DNA的检出率。

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    2.2 两步擦拭法

    两步擦拭法^［2］又称为干湿擦拭法，适用于质地较硬、非渗透性的载体^［3］，比如玻璃、金属材料等。Karla等^［16］分别使用两步擦拭法和胶带粘取法收集“受害人”皮肤表面遗留的“犯罪嫌疑人”的脱落细胞，结果发现两种方法没有明显差别。而随后Oorschot等^［15］通过实验比较了从擦拭棒和胶带提取所获得的有关供体等位基因数，分析发现对于不同的样本两种前处理方法的结果差异不同。在常规的擦拭法中常用蒸馏水浸湿擦拭棒，而Thomasma等^［17］经过研究发现用去垢剂如十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、Tween 20等浸湿擦拭棒后擦拭所得的接触DNA量更高。此外，实验表明，擦拭力度不同也会影响接触DNA的检出率。

    2.3 直接剪取法

    直接剪取法^［2］适用于重点部位较为明确、质地偏软且易于分割的载体，如衣物、绳索等。该法操作简便，获得单一基因分型的可能性大，但是会破坏检材，将载体置于裂解液中也会影响DNA的质量。

    2.4 负压吸附法

    负压吸附法^［2］适用于表面软质、粗糙、易渗透或与身体接触面较大的物品，如衣服、床单等。该法能够富集面积较大载体表面的脱落细胞，提高检验成功率，但会将游离DNA排除在外，导致提取到的接触DNA减少。

    2.5 震荡冲洗法

    除了上述几种方法，“震荡冲洗法”^［12］在法医DNA检验中逐渐被应用。实际工作中，对于体积较小、质地较硬的载体(比如果核、钢珠、指甲等)，一般都采用“两步擦拭法”富集脱落细胞，但某些载体利用“震荡冲洗法”比“两步擦拭法”更能获得满意的分型结果。“震荡冲洗法”能优化操作步骤，在一定程度上避免了力度难以控制的问题。利用“震荡冲洗法”提取时，消化液可以与钢珠表面充分接触，在涡旋震荡下，钢珠表面的脱落细胞可以被消化液充分冲洗掉，完全溶在消化液中，最大限度提高了DNA含量。且此法很大程度避免了检材的污染，可通过控制冲洗时间来提高所获DNA的浓度和质量，极大地提高DNA的纯度。当然“震荡冲洗法”也有局限性，如载体的体积较大，无法置入离心管中，或质地较松软，涡旋震荡时，大量载体自身的成分会混在DNA中，抑制DNA的扩增或严重影响分型结果。

    综上所述，“震荡冲洗法”因其独特性、优越性和现实可行性，将在今后的法医接触DNA检案中发挥更重要的作用。但应改进其局限性，或选取其他前处理方法处理不适用于“震荡冲洗法”的载体。

    接触DNA类检材DNA含量一般较少，检案时切勿忽视检材包装袋上粘附的接触DNA。李越等^［18］通过对装有钢管的包装袋内面进行检验，成功获取了相关检材上的接触DNA。Mariya等^［19］研究证实，在接触DNA检材的包装袋上检出了转移的接触DNA。

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    3 接触DNA检材的基因组DNA提取、纯化与浓缩

    目前，接触DNA的提取纯化方法很多，实际工作中，DNA实验室通常选用在本实验室得到验证的最佳方法。

    目前，磁珠法^［20］因操作简便、DNA提取和纯化一次完成、能有效去除杂质干扰而被广泛使用。手工磁珠法可以通过调整洗脱体积改变提取的DNA含量，但它易造成手工操作的差异。自动化磁珠法能对大批量检材进行提取，但对于皮肤短暂接触的脱落细胞接触DNA检出率低，且流程较机械，还会出现载体堵塞枪头、裂解液转移不充分的情况，容易损耗DNA，影响检出率。因此诸多研究人员通过实践获得了更多有效的接触DNA提取纯化法。

    袁家龙等^［21］针对常见的皮肤接触样本，对4种常用的接触DNA提取法进行比较，发现磁珠联合Kingfisher工作站提取DNA的分型效果最佳，成功率66.7%；Yukl等^［22］利用QIA shredder柱来提取纯化接触DNA获得较高检出率。2015年，骆继怀等^［23］用PrepFiler Express法医DNA提取试剂盒结合AutoMate Express法医DNA提取系统(简称AutoMate法)提取接触性生物检材DNA并进行STR分型，并与Chelex-100法、M48磁珠法、Chelex-100+纯化法进行比较，结果发现AutoMate法提取的接触DNA STR分型成功率最高。

    为获取更高纯度的接触 DNA，可对提取纯化后的接触DNA进行浓缩。徐程等^［24］将30mL(约600pg)纯化后的微量DNA，分别采用Amicon离心超滤管和DNA Clean＆Concentrator^TM-5试剂盒进行浓缩回收。对比发现DNA Clean＆Concentrator^TM-5试剂盒可以明显提高微量DNA检材的检验成功率，效果优于Amicon离心超滤管，但DNA Clean＆Concentrator^TM-5试剂盒目前尚未应用于法医学检案。

    在今后的法医工作中，检案人员需结合上述几种方法，在自动化磁珠法的基础上联合DNA Clean＆Concentrator TM -5等试剂盒进行提取纯化浓缩接触DNA，并可对AutoMate法进一步实验改进，应用于实际检案。

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    4 接触DNA的分型与结果分析

    接触DNA的标记分型目前仍以STR遗传标记检测为主。在实际检验时，由于接触DNA量过少、检材降解以及PCR抑制物的存在等因素，STR遗传标记的分型和结果分析均易受影响，我们可通过以下方式进行改进。

    4.1 改善PCR反应条件

    在原有实验基础上可增加模板DNA输入体积、增加循环参数，若此改进未得到有效的STR分型图谱，PCR扩增时可以考虑采用模板浓缩、缩小反应体系来增加扩增产量，从而提高STR遗传标记的正确分型。徐程^［24］等在研究中对浓缩前后的接触DNA模版分别扩增，结果显示浓缩后的接触DNA检出率远高于浓缩前；同时作者指出，在扩增前，应该对模板DNA进行定量。Robyn等^［25］研究显示，可用post-PCR法，通过改变缓冲体系、加样时间、梯度扩增提高检验的灵敏度，同时运用实时荧光定量PCR进行复合扩增，使用Identifiler等试剂盒进行常染色体STR扩增时，可加做Y-STRs。此方法不仅可以提高灵敏度，还可以提高鉴别能力。为了减少样本处理过程中接触DNA的丢失，Liu^［26］运用聚乙烯擦拭棒(PE-Swab)直接进行STR扩增分型，此法比传统的STR工作流程更加灵敏且花费时间更少。

    4.2 避免干扰因素对DNA分型结果的判读

    对接触DNA进行STR分型时，Robyn等^［25］指出由于接触DNA模板少，DNA模板降解，进行毛细管电泳分离时，容易产生扩增不平衡、等位基因丢失和增加、stutter峰、伪峰等问题。提高峰阈值或采用峰信号过滤，可以消除stutter峰对分型的影响；用0.25μm滤器对配制电极缓冲液的纯水进行过滤，可减少电极缓冲液微粒形成的伪峰；扩增时增加模板量，减少模板丢失和降解，减少反应体系中的抑制剂会降低扩增不平衡率。

    4.3 合理分析STR分型结果

    实际案件中，接触DNA常为混合DNA，检测常染色体STR遗传标记中2个或以上基因座出现3个等位基因时，通常需要考虑检材可能污染或系混合检材，但仅极个别检材在一个基因座出现3个等位基因，不符合混合检材特征。另外，当获得的常染色体STR分型无法解释时，要考虑到DNA来源的不确定性^［27］和二次转移^［1］(second transfer)的可能性。为更好地进行个体识别，可以补充Y染色体上DNA遗传标记用于确定接触DNA检材是否有男性成分、推断人数和父系家系排查等，但检验结果不宜做出肯定的结论，须结合案情加以分析。

    对STR结果进行分析时，要注意杂合性丢失的样本与纯合子的检测结果相似。检测分析时可采用多种试剂盒相互印证分析，进一步提高检材的分型可靠性。为减少接触DNA STR自动分型时的误差，常常进行多次试验再对所获图谱进行分析。常用分析方法有两种^［28］：一是共有图谱分析(consensus profile)法，采信重复出现的等位基因；二是综合图谱分析(composite profile)法，将出现过的等位基因均考虑在内。在具体实践中，大多采用共有图谱分析法，可以取得较好的效果。

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    5 展望

    随着人们对接触DNA的了解和法医学检案应用，接触DNA将会成为侦破案件的重要证据。且在今后案件中不仅要推测嫌疑人所接触的部位以获取接触DNA，还要推断嫌疑人可能经过的区域，在没有接触物体的情况下在相应空间物体上提取接触DNA。相关人员应全面、客观地熟悉各类物体上接触DNA的特点，采用合理、可行的DNA分型方案，得出科学、正确的分析结论。

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